Косметика, медицина

Поскольку в процессе окисления пирувата количество НАДН снижается, величина оптической пдлотности падает и это падение продолжается до тех пор, пока весь имеющийся в пробе пируват не вступит в реакцию. Этот момент соответствует выходу кривой на графике на плато. Так как пируват и НАДН вступают в реакцию в эквимолярных количествах, то убыль НАДН равна количеству пирувата, содержащегося в анализируемом образце. Расчет содержания пирувата может быть произведен на основании коэффициента молярной экстинкции НАДН + Н+, равного 6,22-102 м2 /М по формуле

V 1

C = DE --, (1)

где С - концентрация пирувата в мМ; 8 - коэффициент молярной экстинкции; V1 - объем реакционной смеси; V2 - объем исследуемого образца; d - длина светового пути; АЕ - изменение величины оптической плотности.

Аналогичным образом может проводиться количественное определение всех веществ, являющихся субстратами дегидрогеназ (малат, лактат, сукцинат и т.д.). Построение калибровочных графиков или использование калибраторов здесь не требуется, т.к. расчет ведется по коэффициенту молярной экстинкции. Однако следует заметить, что величина этого коэффициента зависит от состава реакционной среды и в некоторых случаях может незначительно отклоняться от величины 6,22 • 102. Рассмотренная выше ЛДГ-реакция служит в качестве индикаторной при определении активности АлАТ. В этой сопряженной системе реакции протекают по схеме

АлАТ

a -аланин + a -кетоглутарат-> пируват + a -глутамат

пируват + НАДН. Н + ЛДГ > лактат + НАД+

Реакция сопровождается снижением величины оптической плотности при 340 нм, скорость которого пропорциональна активности АлАТ. Аналогичным образом может быть определена активность АсАТ. Но индикаторным ферментом в этом случае будет малатдегидрогеназа. Расчет активности ферментов, определение которых проводится с помощью оптического теста Варбурга, также может быть проведен на основании коэффициента молярной экстинкции по формуле

AE 1 мкМ

Аt 8 d мин л

где АЕ - изменение оптической плотности; At - время измерения (мин); 8 -

2 2

коэффициент молярной экстинкции (6,22 • 10 м /М); d - длина светового пути, см; V1 - объем реакционной смеси; V2 - объем анализируемого образца.

На использовании в качестве индикаторного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) основан самый точный метод из всех существующих методов определения глюкозы. Здесь реакция идет по схеме:

Глюкоза + АТФ -гксокиназа > глюкозо-6-фосфат + АТФ Глюкозо-6-фосфат + НАДФ + -Г6ФДГ > 6-фосфоглюконат + НАДФН. Н+

Глюкоза при участии гексокиназы фосфорилируется в глюкозо-6-фосфат, который с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы окисляется в 6-фосфоглюконовую кислоту. Эта реакция сопровождается накоплением НАДФН и, следовательно, возрастанием оптической плотности при 340 нм. Расчет содержания глюкозы в анализируемом образце может быть произведен по формуле (1).

Другой подход к определению глюкозы основан на использовании сопряженной системы глюкозооксидаза + пероксидаза и более широко известен. При участии глюкозооксидазы глюкоза окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, количество которой определяется по ее способности в присутствии пероксидазы окислять диамины с образованием окрашенных продуктов:

Глюкоза + О2 + Н20 г"юкозооксидаза > глюконовая кислота + Н20 2 Н202 + краситель -перосидаза-> окрашенный продукт + Н20

В качестве красителей (индикаторов) для пероксидазной реакции предложена целая группа веществ: о-толидин, о-дианизидин, фенол+ 4-амино-антипирин и др.

Считают, что реакция с 4-амино-антипирином более предпочтительна, т. к. развивающаяся окраска более стабильна, чем при использовании других веществ.

Эта же пероксидазная реакция с участием 4-амино-антипирина, предложенная Триндером, может быть использована для количественного определения холестерина и триглицеридов.

При определении холестерина его эфиры гидролизуются холестеро-лэстеразой до свободных жирных кислот и холестерина, который под воздействием холестеролоксидазы окисляется кислородом воздуха до D -холестерола. Образующаяся при этом перекись водорода в присутствии пероксидазы окисляет вещества-индикаторы с образованием окрашенных соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию холестерина в исследуемом образце:

Эфиры холестерина х°лестролэс"ерз > холестерин + R-COOH Холестерин + O2 холес"р°локсидазы )А4-холестенон + H2O2 2H2O2 + 4-аминоантипирин + фенол -перосидаза > окрашеннтй продукт + 4H2O2

Описанный метод определения холестерина является самым точным из ныне существующих. В реакции Либермана-Бурхарда, рутинном методе определения холестерина участвуют и другие стерины, что приводит к завышенным результатам. К другим преимуществам ферментативного метода следует отнести отсутствие влияния примесей билирубина и гемоглобина, необходимости проводить длительный гидролиз эфиров и экстракцию холестерина, отсутствие агрессивных реагентов.

Еще более сложная ферментная система может быть использована для определения триглицеридов. Триглицериды расщепляются липазой до жирных кислот и глицерина, который при участии глицерокиназы и АТФ фосфорилируется с образованием глицерол-3-фосфата. Глицерол-3-фосфат в присутствии глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием фосфодиоксиацетона и перекиси кислорода, которая в свою очередь окисляет краситель с образованием окрашенного комплекса, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации триглице-ридов в исследуемом образце.

Триглицерид + 3H2O -липаза > глицерин + 3R-COOH Глицерин + АТФ -глицероки"аза > глицерол-3фосфат + АТФ Глицерол-3фосфат + O2 глицоеPс,лдфаоасфат ) фосфодиоксиацетон + H2O2 H2O2 + 4-аминоантипирин + 4-хлорфенол-перо"сидаза >

пероксидаза

окрашенный комплекс + 2H2O + HCl

Этот метод определения триглицеридов наиболее специфичен, исключительно точен и чрезвычайно прост в исполнении.

В настоящее время разработана целая группа ферментативных методов определения мочевой кислоты. Первым этапом этих методов является расщепление мочевой кислоты уриказой до аллантоина, углекислоты и пе-роксида водорода:

Мочевая кислота + 2H2O + O2 -уриказа > аллантоин + CO2 + H2O2

Образовавшийся пероксид водорода может быть определен разными способами:

- по реакции с 4-аминоантипирином или другим аналогичнтм красителем;

- превращением метанола с участием каталазы в формальдегид, который определяется специальными методами; Заказать профессиональную косметику по адресу. Косметика обзор фото, советы заказать косметику.