Косметика, медицина

3. Время начала и окончания ферментативной реакции следует фиксировать по секундомеру, причем в случае определения активности ферментов и кинетических методов определения аналитов для каждой отдельной пробы, а не для серии целиком, иначе результаты анализа будут неверны. Началом реакции считается момент добавления сыворотки (или стартера) в реакционную смесь, а также окрашивающего реагента, если реакция двухстадийная. Для кинетических методов, когда анализ в нескольких пробах проводят последовательно, время начала реакции и равные промежутки времени между фотометрированиями следует точно фиксировать по секундомеру для каждой отдельной пробы. Так как определение, как правило, проводят в нескольких пробах, сыворотку в реакционную смесь в параллельных пробах следует вносить через четко фиксированные по секундомеру промежутки времени, например через 30 с или 1 мин. Началом реакции считается внесение сыворотки в первую пробу из серии. По истечении времени реакции следует с таким же интервалом останавливать реакцию в параллельных пробах, т. е. вносить реагент, например щелочь, с интервалом 30 с или 1 мин, соответственно. Таким образом, время реакции будет фиксировано для каждой отдельной пробы. Исключением из этого правила может быть только метод Райтмана-Френкеля. Так как время ферментативной реакции в этом методе - 1 ч, то допущенное отклонение во времени между параллельно определяемыми пробами при серийном запуске и остановке реакции будет относительно небольшим и внесет незначительную ошибку в конечный результат по сравнению с ошибкой самого метода.

4. Перед началом ферментативной реакции температуру рабочего реагента необходимо довести до значения, указанного в инструкции, и обеспечить его поддержание в течение всего времени анализа с точностью ±0,1°С. В случае ферментативных методов анализа аналитов желательно, а при определении активности ферментов обязательно использовать водяную баню (водяной термостат). Так как теплопроводность воды значительно выше теплопроводности воздуха, водяной термостат быстрей и надежней обеспечивает установку и поддержание заданной температуры реакционной смеси. Например, чтобы довести температуру 1 мл реакционной смеси до 37 °С, в суховоздушном термостате ее необходимо выдержать 10 мин, а в водяной бане - 5 мин. Если время анализа выдерживают для каждой отдельной пробы, а не для серии целиком, технически с водяной баней работать удобней.

5. Ни в коем случае нельзя изменять соотношение рабочий реагент/сыворотка. Его уменьшение в целях экономии может привести к сужению линейной области определения в случае определения активности фермента и к неполному превращению аналита в случае ферментативных методов анализа, т.е. к получению заниженных результатов. При увеличении соотношения рабочий реагент/сыворотка снижается чувствительность метода.

6. Также нельзя разбавлять рабочий реагент в целях экономии, т. к. при этом условия реакции (концентрация буфера, активаторов и т. д.) отклонятся от оптимальных, что приведет к занижению результатов анализа как в случае определения активности ферментов, так и в случае определения аналитов ферментативными методами.

7. Если концентрация фермента или другого аналита в биологической жидкости превышает верхнюю границу линейности набора, то исследуемую пробу необходимо разбавить строго в соответствии с рекомендациями, изложенными в инструкции к набору (чем разбавлять и во сколько раз). Несоблюдение указаний может привести к серьезным ошибкам, т. к. в сыворотке присутствует огромное количество соединений, тем или иным образом влияющих на аналит и результат его определения (особенно это касается ферментов). Для получения точных и воспроизводимых результатов пробу вообще лучше не разбавлять, тем более что активность некоторых ферментов, например АлАТ и АсАТ, непропорционально уменьшается при разбавлении. Однако не всегда линейная область определения набора позволяет охватить весь диапазон физиологических концентраций аналита. Надо стремиться разбавлять пробу минимально, желательно, в 2-3 раза (особенно при определении активности ферментов) и не больше, чем указано в инструкции. Разумеется, для разведения нельзя использовать маленькие аликвоты (10-20 мкл); чтобы уменьшить ошибку разведения, лучше взять хотя бы 100 мкл пробы.

8. Фотометрирование следует проводить в указанном в инструкции диапазоне длин волн, отклонение может существенно снизить чувствительность метода. В случае расчета концентрации аналита или активности фермента по коэффициенту экстинкции длина волны должна точно соответствовать указанной в инструкции. Так как коэффициент экстинкции -это оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 мкМ в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 1 см при данной длине волны, то для другой длины волны значение его будет иным и может значительно отличаться.

9. Длина оптического пути кюветы для фотометрирования должна соответствовать указанной в инструкции. Использование кюветы с меньшей длиной оптического пути снизит чувствительность метода.

10. При построении калибровочных кривых необходимо делать не менее 4-5 параллельных определений холостой пробы и каждого стандартного образца указанной в инструкции концентрации. Строить калибровочную кривую следует для каждой серии набора, а также при смене фотометрического оборудования.

11. Калибровочную пробу, используемую для расчета концентрации аналита или активности фермента, необходимо ставить для каждой серии анализов в четырех параллелях.

12. Следует тщательно мыть посуду, пипетки, наконечники и многократно ополаскивать их дистиллированной водой. Для мытья можно использовать только моющие средства, не содержащие биодобавки, т. к. в их состав входят протеазы, которые даже в следовых количествах могут разрушить ферменты в реакционной смеси. Особенно тщательно следует отмывать перекись водорода, используемую для обеззараживания пробирок и наконечников. Н2О2 является одним из продуктов сопряженных ферментативных реакций при определении глюкозы, холестерина, триглицеридов и т. д. Поэтому наличие экзогенного пероксида водорода завысит результаты анализа.

13. Необходимо следить за качеством дистиллированной воды, используемой в процессе анализа. Избыток некоторых ионов, входящих в ее состав, может ингибировать ферменты.

14. При работе с ферментативными наборами так же, как и при работе с другими наборами реагентов, желательно, а при отборе проб малых объемов (30-10 мкл) обязательно следует пользоваться проверенными автоматическими микродозаторами. Наконечники к ним лучше повторно не использовать, особенно те, которыми проводили отбор сыворотки и затем обеззараживали пероксидом водорода, по указанным выше причинам. При отборе калибратора использовать только новые наконечники.

15. Для получения достоверных результатов очень важен преанали-тический этап. По литературным источникам доля ошибок доаналитиче-ского этапа в общем числе лабораторных ошибок составляет не менее 50 %. На долю аналитического этапа приходится не более 20 % ошибок, при этом значительная часть их связана с отсутствием стандартов на выполнение операций доаналитического этапа. На долабораторном этапе большое значение имеет процедура взятия крови у пациента, транспортировка в лабораторию, пробоподготовка и хранение пробы до анализа. Неумелое взятие крови может привести к ложным результатам. В качестве примера можно привести следующие факторы доаналитического этапа, которые могут существенно повлиять на результаты определения активности ферментов. Так, продолжительный веностаз может привести к гипоксии и увеличению проницаемости мембран клеток крови, что скажется на активности ряда ферментов. Другой негативный фактор - гемолиз; при длительном стоянии крови появляющиеся активные радикалы кислорода и дефицит субстратов приводят к порозности мембран эритроцитов. Гемолиз, освобождение ферментов из лейкоцитов и тромбоцитов могут привнести заметные изменения в активность ЛДГ, АсАТ, АлАТ, кислой фосфатазы в сыворотке. ЛДГ и кислая фосфатаза присутствуют в высоких концентрациях в тромбоцитах, поэтому активность этих ферментов в сыворотке выше, чем в плазме. При свертывании крови в сыворотке появляются ферменты из тромбоцитов, в частности кислая фосфатаза, поэтому при работе с сывороткой рекомендуется как можно быстрее отделить ее от сгустка. Заказать профессиональную косметику. Заказать christina косметику форум.